細胞克隆實驗

        隨著二氧化碳培養(yǎng)箱的普及，現(xiàn)在用二氧化碳培養(yǎng)箱來做實驗的人越來越多，下面喆圖小編就給大家講解一下細胞克隆的實驗方法。
細胞克隆或集落的原理：
        當單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。每個克隆含有50以上的細胞，大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細胞的獨立生存能力。克隆形成率反映細胞兩個重要性狀：細胞群體依賴性、增殖能力。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大：
        a）.初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；
        b）.二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；
        c）.正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。
實驗方法
       1.平板集落形成實驗：本法適用于貼壁生長的細胞和正常培養(yǎng)的細胞。
注：適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。
         2.軟瓊脂集落形成實驗：本法適用于非錨著依賴性生長的細胞，如骨髓造血干細胞、腫瘤細胞株、轉(zhuǎn)化細胞系。
注：正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。

      實驗步驟如下：
    一、平板克隆形成實驗基本步驟：
    1.取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
    2.將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
     3.經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
       4.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)。后計算克隆形成率。
    克隆形成率 =（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%
二、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗基本步驟：
     1.取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。
     2.用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。
      3.按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。
      4.按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天。
      5.把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數(shù)。計算形成率。 軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。
注意事項
     1.接種時細胞密度適度，不可過高。
     2.軟瓊脂與細胞混合時溫度不能超過40℃，否則將會燙傷/死細胞；
     3.瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定，若反復加熱，容易降解而產(chǎn)生毒性，且硬度下降。因此高壓滅菌后應進行分裝；
        4.細胞在進行克隆形成實驗時要求有95%以上的分散度，否則結(jié)果的準確度會受到很大影響；
        5.細胞在低密度、非貼壁狀態(tài)條件下培養(yǎng)，生存率明顯下降，永生細胞系/株克隆形成率可達到10%以上，但初代培養(yǎng)細胞和有限傳代細胞系克隆形成率僅為0.5%-5%，甚至無法形成單個克隆。因此，為了提高克隆形成率，有時需要在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)。
       6.細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。
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