樹舌靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

    今天喆圖小編就來說說樹舌靈芝又稱樹舌扁靈芝，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非菌褶目、靈芝菌科、靈芝屬。樹舌具有廣泛的藥理活性，民間用其治療食道癌、肺結(jié)核，臨床用于治療腹水癌、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝炎、心臟病、糖尿病和糖尿病并發(fā)癥，預(yù)防和治療胃潰瘍、急慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃酸過多等胃病。另外研究表明，樹舌三萜類物質(zhì)具有血壓雙向調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性。目前國(guó)內(nèi)對(duì)樹舌靈芝的化學(xué)成分和藥理學(xué)研究得比較多，但對(duì)樹舌靈芝深層發(fā)酵方面的研究較少。深層發(fā)酵培養(yǎng)樹舌菌絲體具有發(fā)酵周期短、工藝簡(jiǎn)單、易控制、適于工業(yè)化大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)應(yīng)用高氯酸——香草醛顯色法來測(cè)定樹舌靈芝發(fā)酵菌絲總?cè)祁惢衔锖?，以總?cè)飘a(chǎn)量為基準(zhǔn)，篩選出樹舌靈芝深層發(fā)酵的適培養(yǎng)基。

    通過單因素試驗(yàn)，確定樹舌靈芝的適宜氮源為豆餅粉，適宜碳源為米糠和蔗糖；在此基礎(chǔ)上，以篩選的碳源、氮源和無機(jī)鹽KH2PO4 和MgSO4·7H2O為考察因素，以總?cè)飘a(chǎn)量為主要指標(biāo)利用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方比例，確定樹舌靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：米糠4%、蔗糖1%、豆餅粉4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%。  

     一、 （材料和儀器 ）

    1、實(shí)驗(yàn)所需材料  硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、高氯酸、冰醋酸、香草醛均為分析純；齊墩果酸對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；豆餅粉、玉米粉、麥芽粉、甘薯粉、米糠和麩皮均為提取液，煮沸0.5h后用紗布過濾制得。 

    2、實(shí)驗(yàn)用主要儀器設(shè)備 

鼓風(fēng)干燥箱，立式高壓滅菌鍋，電子天平，紫外分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱。  

    二、（實(shí)驗(yàn)方法  ：基本培養(yǎng)基）  

    1.1 斜面培養(yǎng)基  PDA培養(yǎng)基為土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。接一塊綠豆粒菌塊接種于PDA培養(yǎng)基的中央，放入恒溫培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)7天。 

    1.2 液體培養(yǎng)基  玉米粉1%，蔗糖2%，蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。 

    1.3 氮源篩選培養(yǎng)基  葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，PH自然。分別以豆餅粉、麩皮、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀為氮源，添加量為2%。 

    1.4 碳源篩選培養(yǎng)基  麩皮2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、麥芽粉、甘薯粉、米糠等為碳源，添加量為3%。  

培養(yǎng)方法  

    2.1 種子液制備  將斜面菌種分割成黃豆大小，接種到液體培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量100mL，于恒溫?fù)u床中25℃，120r/min振蕩培養(yǎng)10d得一級(jí)種。將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級(jí)種以體積分?jǐn)?shù)10%接種到同樣液體培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝液量200mL，在與一級(jí)種同樣條件下培養(yǎng)7d得種子液備用。  

    2.2 培養(yǎng)基篩選  將制備好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接種到不同的碳氮源培養(yǎng)基及正交試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量100mL，于恒溫?fù)u床中25℃，120r/min振蕩培養(yǎng)7d后收集菌絲體。分析不同碳源、氮源對(duì)菌絲體生物量和三萜總量的影響。每次試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。   

    2.3 混合碳氮源培養(yǎng)基正交試驗(yàn)  根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果，并考慮到低投入高產(chǎn)出的原則，選用米糠和蔗糖作為復(fù)合碳源，豆餅粉作為氮源，磷酸二氫鉀和硫酸鎂作為無機(jī)鹽，按L9（34）設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，9個(gè)組合，4次重復(fù)，優(yōu)化培養(yǎng)基。  

    2.4 發(fā)酵菌絲體生物量測(cè)定  采用細(xì)胞干重法，取100ml發(fā)酵液，用100目紗網(wǎng)過濾得菌絲體，并用蒸餾水反復(fù)沖洗，至濾出液澄清為止，收集菌絲體，于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，稱重。  

    三、（三萜含量測(cè)定）  

    3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備（200μg/ml齊墩果酸） 稱取干燥至恒重的齊墩果酸20mg，置于100ml的容量瓶中加無水乙醇溶解，并定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。 

    3.2 樣品溶液的制備   取樣品0.5g（到萬分之一），加入10ml無水乙醇，超聲波提取30min后，搖勻，過濾，取濾液，定容至50mL，即得樣品溶液。用分光光度法測(cè)定樣品中靈芝三萜物質(zhì)含量。  

    3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作   精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL, 于6只具塞磨口試管中。加5%香草醛-冰醋酸液0.4mL，搖勻。再加入0.6mL高氯酸，置于60℃恒溫水浴鍋中20 min，冰浴冷卻后，加冰醋酸5.0 mL，搖勻，置于室溫15 min后，按分光光度法（《中國(guó)藥典》2005版 I部附錄VA），以試劑為空白，在545nm處比色測(cè)定吸光度值。以齊墩果酸濃度（?g/ml） 為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

    3.4 樣品的測(cè)定   吸取1ml樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總?cè)扑崽崛∥镔|(zhì)量。  

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