微生物的實驗室培養(yǎng)

　　1. 培養(yǎng)基是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎。
 

　　2. 常見的培養(yǎng)基包括：液體狀態(tài)的液體培養(yǎng)基，可用于工業(yè)生產(chǎn)；添加了凝固劑(如瓊脂)的固體培養(yǎng)基，常用于微生物分離、鑒定，活菌計數(shù)，菌種保藏等，微生物在固體培養(yǎng)基表面生長可形成肉眼可見的菌落。
 

　　3. 培養(yǎng)基一般都含有水、碳源(包括無機碳源如CO2、有機碳源如葡萄糖)、氮源(包括無機氮源如NH3、有機氮源如蛋白質(zhì))和無機鹽。
 

　　4. 培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)(即生長因子)以及氧氣的要求。
 

　　5. 獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵。
 

　　6. 消毒是使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)；滅菌是使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
 

　　7. 常用的消毒方法：煮沸消毒法(在100 ℃煮沸5～6 min)，日常生活中常用于一般物品的消毒；巴氏消毒法用水浴鍋操作(在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min)，用于一些不耐高溫的液體，如牛奶的消毒；化學藥劑消毒法，如用酒精擦拭雙手、用Cl?消毒水源等；紫外線消毒法(紫外燈照射30 min)，用于接種室、操作臺的表面滅菌和空氣滅菌。
 

　　8. 常用的滅菌方法：灼燒滅菌(酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒)，用于接種工具或其他金屬用具的滅菌和試管口或瓶口的滅菌；干熱滅菌(在干熱滅菌箱內(nèi)160～170 ℃加熱1～2 h)，用于玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬工具等的滅菌；高壓蒸汽滅菌(在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)壓力為100 kPa，溫度為121 ℃的條件下15～30 min)，用于培養(yǎng)基及容器的滅菌。
 

　　9. 制作蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟：①計算各成分的用量；②稱量，注意要使用稱量紙、動作要迅速、稱后及時蓋瓶蓋；③溶化，注意將膏連同稱量紙一起放入燒杯，保證粘附在稱量紙上的膏也能溶入水中；④滅菌，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至錐形瓶，加棉塞，包上牛皮紙，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌15~30min，將5~8套培養(yǎng)皿用幾層報紙包緊作一包，在干熱滅菌箱內(nèi)滅菌2h；⑤倒平板，培養(yǎng)基50℃左右時在酒精燈火焰附近操作。
 

　　10. 倒平板時要注意：全程在酒精燈火焰附近操作；錐形瓶的瓶口通過火焰灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙即可；等待平板冷卻凝固(大約需5～10min)后，將平板倒過來放置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。
 

　　11. 菌落是單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，形成的肉眼可見的、具有一定形態(tài)結構的子細胞群體。
 

　　12. 平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，MAX終分離得到單菌落。
 

　　13. 接種環(huán)的灼燒：①劃線前：消滅接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)物；②每次劃線前：殺死接種環(huán)上的殘留菌種，保證每次劃線菌種來自上次劃線末端；③劃線結束后：殺死接種環(huán)上的殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。
 

　　14. 灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后再進行操作，以免接種環(huán)溫度太高殺死菌種。
 

　　15. 第二次劃線以及其后的劃線操作，要從上一次劃線的末端開始劃線，使細菌的數(shù)目隨著劃線的次數(shù)增加而逐步減少，MAX終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
 

　　16. 稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。其主要操作步驟包括系列稀釋操作和涂布平板操作。
 

　　17. 稀釋涂布平板法操作時，應注意以下操作以防止雜菌污染：每支試管及其中的9 mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2 cm處；涂布器用體積分數(shù)為70%酒精消毒，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃；移液管管頭不要接觸任何物體。
 

　　18. 稀釋涂布平板法可用于微生物計數(shù)，但需涂布多個平板，操作較復雜。
 

　　19. 未接種的培養(yǎng)基可作為空白對照，若其在恒溫箱保溫1~2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制作是成功的，否則需要重新制備。
 

　　20. 若接種成功，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。
 

　　21. 對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后，將試管放入4℃的低溫培養(yǎng)箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。
 

　　22. 菌種的臨時保藏方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。
 

　　23. 對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的低溫培養(yǎng)箱中保存。
 

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