用恒溫水浴鍋提取動物組織細(xì)胞基因組DNA

        一、儀器及試劑

        ⒈儀器：

恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）

        ⒉試劑：

（1）細(xì)胞裂解緩沖液：

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

（2） 蛋白酶K： 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。

（4）酚： CHCl3：異戊醇（25:24:1）

（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

        二、操作步驟

        ⒈取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

        ⒉加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）

        ⒊加等量的酚? CHCl3?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

        ⒋取上層溶液至另一管，加入等體積的 CHCl3?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

        ⒌取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

        ⒍小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

        ⒎用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

        ⒏小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

        ⒐加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        ⒑吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

        三、常見問題

        ⒈選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。

        ⒉在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA團(tuán)塊形成。

        ⒊提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。

        ⒋電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。

        ⒌分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入SDS  至終濃度為0.5%，并重復(fù)步驟2～8。

        ⒍酚/ CHCl3/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。