細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作流程

       今天小編給大家講解一下細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過程：

      首先將新鮮培養(yǎng)基置于37℃電熱恒溫水浴鍋中回溫，回溫后噴以75%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。如配置：50mL*培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青鏈霉素雙抗)44.5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。戴防護(hù)手套后，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡），輕搖冷凍管使其在2分鐘內(nèi)全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

      然后將解凍的1mL細(xì)胞懸液緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，再向瓶中加入10mL*培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10)，混合均勻，放入37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸液作存活測試。(Sf9細(xì)胞在27℃生長，可不需CO2) 。 一般而言，細(xì)胞大都不需立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO)。若要立即去除，則將解凍的細(xì)胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1300rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
       37℃恒溫培養(yǎng)約48小時，待細(xì)胞長滿80-90%后，從培養(yǎng)箱取出75cm2培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩沖液。沿壁（無細(xì)胞的一面）緩緩加入1mL胰酶溶液消化細(xì)胞約1min，輕輕搖晃，倒掉殘余胰酶，將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min，拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細(xì)胞貼壁的一面。 

       注意：消化溫度是37℃，加液后用移液管反復(fù)吹打分散細(xì)胞。 

      向瓶中加入5mL*培養(yǎng)基，反復(fù)吹打均勻2min，從中取出20μl至0.5ml小離心管中，向管中加入80μl臺盼藍(lán)溶液，混勻，從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計(jì)數(shù)板上，計(jì)算細(xì)胞密度及活率。將5mL細(xì)胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中，其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL*培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（細(xì)胞傳代時按1：5或更大比例稀釋）
    細(xì)胞凍存： 
   1. 冷凍前確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期，傳代后的5mL細(xì)胞懸液取出1mL接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無菌離心管，將剩余4mL細(xì)胞懸液置于其中，離心1000rpm，5min（轉(zhuǎn)速勿超過1500rpm）。 
   2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細(xì)胞沉淀。向離心管中加入900ul*培養(yǎng)基，用槍頭反復(fù)吹打重懸起細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。一般細(xì)胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜。 
   3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5mL無菌凍存管中，再加入100ul試劑級DMSO，混勻，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO后濃度為10％）。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期，然后進(jìn)行凍存。 
    注意：對Sf9細(xì)胞而言，凍存比例為：95%培養(yǎng)液+5%DMSO。 
   4. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時（隔夜）→液氮罐長期儲存。（-20℃勿超過1小時，防止胞內(nèi)冰晶過大造成細(xì)胞死亡）