用電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大腸桿菌

實(shí)驗(yàn)所需儀器：超凈臺、離心機(jī)、高壓滅菌鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、培養(yǎng)皿、涂布器、移液管、移液器

實(shí)驗(yàn)所需試劑：牛肉高蛋白胨培養(yǎng)基相關(guān)試劑、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理鹽水

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1制備培養(yǎng)基 

　　普通培養(yǎng)基——牛肉高蛋白胨培養(yǎng)基（400ml）：

牛肉高5g蛋白胨10gnacl5g瓊脂20g蒸餾水1000mlph7.0

　　按配方配制好培養(yǎng)基后置于滅菌鍋中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5組+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml

　　篩選培養(yǎng)基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能結(jié)合細(xì)菌核糖體的30s亞基上的16srRnA，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。）

　　牛肉高5g蛋白胨10gnacl5g瓊脂20g蒸餾水1000mlph7.0硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）0.2ml，按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min滅菌，取出培養(yǎng)基后冷卻至60℃時將硫酸卡那霉素0.2ml加入培養(yǎng)基中，充分震蕩混勻，倒平板，2皿*15ml*5組+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml2.2.2制備菌懸液（106~108個/mL）

　?、俟腆w培養(yǎng)：大腸桿菌劃線或涂布接種于固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48h。

　　②菌懸液：用適量生理鹽水刮洗菌落，倒入一個無菌小三角瓶（或試管）中，充分振蕩使菌

　　體散開，得到菌懸液。

　?、劬鷳乙簼舛扔醚蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)

　　使用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。將菌液滴在血球計(jì)數(shù)板0．1ml的計(jì)數(shù)格中，細(xì)菌被固定染色后，在顯微鏡下選擇數(shù)出若干個小格中的細(xì)菌數(shù)目，（一般數(shù)125個小格），根據(jù)比例關(guān)系折算出單位體積菌液中細(xì)菌的數(shù)量。

　　血球計(jì)數(shù)板規(guī)格：計(jì)數(shù)格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格

　　小格體積=0.05*0.05*0.1=0.00025mm3=2.5*10-7ml(長*寬*高)

　　計(jì)算方法例如：125格中90個細(xì)菌，則（90÷125）÷（2.5*10-7）個/ml=2.88*106所以，125格中的細(xì)菌大約在31(4格1個菌)—3125（每個小格25個菌）個。2.2.3誘變處理及接種

　?、賹⒆贤鉄舸蜷_，預(yù)熱30min；

　　②取無菌培養(yǎng)皿（Φ90mm，含無菌大針），加入稀釋好的菌懸液8ml以覆蓋培養(yǎng)皿底面為宜。

　?、蹖⒋幚淼呐囵B(yǎng)皿置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌儀上，開啟磁力攪拌儀旋紐進(jìn)行攪拌1分鐘，然后打開皿蓋，分別處理10s、20s、40s、80s、160s（可以累積照射），照射完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉攪拌和紫外燈；

　?、苊總€照射劑量分別取0.5ml分別稀釋1000倍和100倍，然后取稀釋液0.1ml

　　做普通培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)，每個處理兩個重復(fù)；同時每個照射劑量取0.1ml照射液直接做兩個篩選培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)。⑤對照涂布培養(yǎng)：將照射的菌液稀釋1000倍，在稀釋液中取0.1ml做2個普通培

　　養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，2個篩選培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)。涂布要均勻，培養(yǎng)基表面無液流。⑥37℃培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析。對于篩選的抗性菌種進(jìn)行驗(yàn)證、純化。

　　2.2.4.結(jié)果計(jì)數(shù)、分析、統(tǒng)計(jì)及討論

　?、僖暂椛鋾r間為橫坐標(biāo)，以存活菌落數(shù)的lg值為縱坐標(biāo)，作紫外線對大腸桿菌致死效應(yīng)曲線。

　?、诹泄接?jì)算不同輻射劑量下的致死率。

　　照射前活菌數(shù)/ml?照射后活菌數(shù)/ml

　　照射前活菌數(shù)/ml

　?、塾?jì)算并比較不同輻射劑量下大腸管桿菌的抗藥突變率，并分析不同輻射劑量的誘變效果差異原因

　　突變率=篩選平板菌數(shù)/普通平板菌數(shù)*100%④抗藥性菌株的篩選與純化

　　將一抗性克隆劃線到一新的抗性平板上，與對照菌相比較，觀察生長狀況