用二氧化碳培養(yǎng)箱做細(xì)胞培養(yǎng)及凍存

  首先做實(shí)驗(yàn)所需儀器耗材如下：
    二氧化碳培養(yǎng)箱、液氮罐、超低溫低溫冰箱、電熱恒溫水浴鍋、離心機(jī)等。

   培養(yǎng)皿、滴瓶、吸管、離心管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)瓶等

下面小編給大家說(shuō)下簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)步驟

    將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃電熱恒溫水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移入15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心2min，棄上清液。加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤(pán)中，在含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

     細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放入二氧化碳培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管離心2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)滅菌，保存于40℃）吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×105/盤(pán)接種，在含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

       加入1ml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)，立即放入一80℃超低溫冰箱內(nèi)，過(guò)夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放入可以保存90天。