新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細(xì)胞培養(yǎng)

      背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，NGF Levi-Montalcini的實(shí)驗(yàn)表明，外原性NGF能刺激DRG細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長(zhǎng)在一天之內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細(xì)胞，進(jìn)行軸突生長(zhǎng)發(fā)育的研究，是最為經(jīng)典而常用的方法之一。二氧化碳培養(yǎng)箱是通過(guò)對(duì)周圍環(huán)境條件的控制制造出一個(gè)能使細(xì)胞/組織更好地生長(zhǎng)的環(huán)境，條件控制的結(jié)果就會(huì)形成一個(gè)穩(wěn)定的條件：如恒定的酸堿度（pH值：7.2-7.4）、穩(wěn)定的溫度（37°C）、較高的相對(duì)濕度（95％）、穩(wěn)定的CO2水（5％）。因此，動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)少不了用它。

       1、材料和方法

取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠(昆明種)。用眼科剪在無(wú)菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。 剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105 個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml細(xì)胞懸液置。置標(biāo)本于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

       2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液：80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L)；10%胎牛血清；10%馬血清；NGF 20ng/ml；谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3  3.7g/L,)；5 % 馬血清；NGF 20ng/ml；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。

       3、新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h，大部分細(xì)胞可貼壁，呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細(xì)胞核位于中央或偏于胞體一側(cè)，核仁明顯，亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h，大部分貼壁細(xì)胞開始長(zhǎng)出突起。其中多數(shù)為具有多個(gè)突起的多極神經(jīng)元，少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元，突起細(xì)長(zhǎng)，并可觀察到突起末端的生長(zhǎng)錐。除單個(gè)散布的神經(jīng)元外，還常見到幾個(gè)或多個(gè)神經(jīng)元聚集在一起，它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經(jīng)突起。 培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長(zhǎng)，形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密，神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可在二氧化碳培養(yǎng)箱維持培養(yǎng)2個(gè)月。

       4、新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)分化基本上與新生大鼠相似，但小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的胞體較大鼠稍小。神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。小鼠背根節(jié)神經(jīng)元亦可在二氧化碳培養(yǎng)箱維持培養(yǎng)2個(gè)月。

       5、雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征

雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節(jié)神經(jīng)元以假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節(jié)培養(yǎng)神經(jīng)元相比，神經(jīng)突起分枝較少。神經(jīng)元胞體稍小，神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。雞胚背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。

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