使用二氧化碳培養(yǎng)箱完成細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)

（1） 準(zhǔn)備

   無(wú)菌超凈臺(tái)，酒精燈，75%酒精噴壺，二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃水浴鍋，離心機(jī)；培養(yǎng)瓶，含10%胎牛血清的*培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺(tái)使平衡到室溫），無(wú)菌工作服（白大褂），手套，記號(hào)筆

（2） 步驟

   1.穿好無(wú)菌工作服，帶上*罩和手套，快速?gòu)囊旱锶〕鰞龃婀埽焖俜胚M(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細(xì)胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂，防止污染。

   2.解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。

   3.開(kāi)超凈臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準(zhǔn)備），凍存管放超凈臺(tái)，換新手套，小心打開(kāi)凍存管，避免污染，無(wú)菌吸管將1ml細(xì)胞全部吸出至5ml無(wú)菌EP管，補(bǔ)加9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?000rpm，離心5min使細(xì)胞沉淀，棄上清。

   4.加入新鮮配制的含10%血清的培養(yǎng)基4ml，輕輕混勻，用吸管將細(xì)胞移至25T培養(yǎng)瓶。

   5.平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

   6.培養(yǎng)24小時(shí)后，顯微鏡觀察細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）貼壁后，小心更換培養(yǎng)基，根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶上標(biāo)記：操作者，時(shí)間，細(xì)胞類(lèi)型。

   7.有的實(shí)驗(yàn)員的培養(yǎng)基會(huì)加入抗生素防止細(xì)胞污染，但是這對(duì)于掌握細(xì)胞培養(yǎng)是非常不利的，不加抗生素培養(yǎng)細(xì)胞更能提醒實(shí)驗(yàn)者無(wú)菌操作的意識(shí)。一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染，易于發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)污染的細(xì)胞應(yīng)立刻煮沸丟棄，以免污染同實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞。

   8.細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%-100%即可傳代，小心打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口過(guò)酒精燈消毒，棄培養(yǎng)基。

   9.加入1mlPBS，潤(rùn)洗細(xì)胞，重復(fù)3次，棄PBS。

   10.加入4ml*培養(yǎng)基，用無(wú)菌吸管小心吹打貼壁細(xì)胞或者用胰蛋白酶消化細(xì)胞使細(xì)胞脫落。

   11.轉(zhuǎn)移1/2脫落的細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶，各瓶補(bǔ)加*培養(yǎng)基至4ml。

   12.小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

   13.待長(zhǎng)滿(mǎn)后，按同樣的方法傳代培養(yǎng)。二  凍存

當(dāng)不需要使用細(xì)胞或者細(xì)胞量足夠時(shí)，可以將細(xì)胞凍存起來(lái)，供以后實(shí)驗(yàn)用

（1） 準(zhǔn)備自

    細(xì)胞凍存液（20%血清、10%DMSO、70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液），梯度降溫盒

（2） 步驟

        1.選取活力好，密度約70%細(xì)胞用于凍存，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于凍存。

        2 .細(xì)胞吹打或者胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管，1000rpm里面5min。

        3.棄上清，加入新鮮配制的細(xì)胞凍存液，25T細(xì)胞可以加入2ml細(xì)胞凍存液，分裝2個(gè)凍存管，細(xì)胞*密度為5*106-1*107個(gè)每ml。

        4.做好標(biāo)記，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）。

        5.將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過(guò)夜，DI二天取出凍存管，快速放入液氮保存。

氧化碳培養(yǎng)箱是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的必要設(shè)備，那么在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)有哪些經(jīng)驗(yàn)是我們可以借鑒的呢？下面讓我們一起來(lái)看一下。

1、啟蒙老師的重要性

一般進(jìn)實(shí)驗(yàn)室都有師兄師姐帶著做，他們就是你做細(xì)胞的啟蒙老師。他們的操作手法、細(xì)節(jié)、理論講解就成了你操作的準(zhǔn)則，如營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞瓶的擺放位置；滅菌處理程序；開(kāi)蓋手法；細(xì)胞吹打手法等等。要學(xué)會(huì)他們的正確操作，在DI一次的時(shí)候就要重視。

2、像養(yǎng)孩子一樣養(yǎng)細(xì)胞

細(xì)胞真的很脆弱，*好每天都去看看它，以防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、缺二氧化碳、停電、溫度不夠等異?，F(xiàn)象，也好及時(shí)解決這些意外，避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的更大痛苦。

3、好細(xì)胞要及時(shí)保種

細(xì)胞要分批傳代，這樣即使有一批出了問(wèn)題，還有一批備用的。像后者一般人可能不容易做到。有一次細(xì)胞污染了，全軍覆沒(méi)。當(dāng)時(shí)可后悔沒(méi)有保種。

4、每種細(xì)胞都有自己的特性，要區(qū)別對(duì)待。

細(xì)胞跟人一樣，不同的細(xì)胞，培養(yǎng)特性是不一樣的。培養(yǎng)過(guò)程中要細(xì)細(xì)體會(huì)。不同細(xì)胞株使用不同的培養(yǎng)基和血清。

如平滑肌細(xì)胞很活躍，喜歡熱鬧，2~3 天就好多人口，而且不太愛(ài)吃喝，真是*好養(yǎng)的孩子了。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞性格相近，不過(guò)它很不講衛(wèi)生，也很邋遢，里面有很多分泌屋，要經(jīng)常換洗才行。RAW264.7 細(xì)胞也很開(kāi)朗，而且很能吃，要經(jīng)常喂它，頭疼的是細(xì)胞很容易活化，培養(yǎng)它的瓶子和環(huán)境沒(méi)有內(nèi)毒素才好。

5、培養(yǎng)前的工作準(zhǔn)備充分

包括耗材的處理、試劑的配置，無(wú)菌檢驗(yàn)等等。
玻璃器皿的清洗。對(duì)于玻璃器皿（細(xì)胞瓶、裝營(yíng)養(yǎng)液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干凈（注意死角），然后沖干凈。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水沖洗 10 遍，除去殘留酸液。瓶子之類(lèi)，沖洗過(guò)程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，160℃ 干烤 2 h 待用。
試劑配置。細(xì)胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。
無(wú)菌檢驗(yàn)。主要采用過(guò)濾除菌：如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各類(lèi)培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。有些可以采用高壓滅菌：如 PBS、D-Hank's等。

6、試劑分裝保存

包括營(yíng)養(yǎng)液、胰酶、血清等。

血清特別重要。血清必須貯存于 –20℃，如果一次無(wú)法用完一瓶，可將 40～50ml 分裝于無(wú)菌酸處理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。一般廠商提供的血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。（一般情況下不影響細(xì)胞培養(yǎng)）

瓶裝血清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝，在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

熱滅活是指 56℃，30 分鐘加熱已*解凍之血清。水浴鍋升到 56℃后，將血清放入，待溫度升高到 56℃ 后計(jì)時(shí)，一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。注意更換新血清（包括不同批次）對(duì)細(xì)胞的影響。

7、無(wú)菌意識(shí)要強(qiáng)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，超凈臺(tái)以紫外燈照射 30 分鐘滅菌，以 70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟超凈工作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。

每次操作只處理一株細(xì)胞株，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以 70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。

無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暫時(shí)放置，其它個(gè)人實(shí)驗(yàn)用品用完應(yīng)立即拿出。實(shí)驗(yàn)用品以 70% 乙醇擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在中央無(wú)菌區(qū)域，一般勿在邊緣區(qū)域操作。

小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

8、選擇正確的培養(yǎng)基 

不同的細(xì)胞可能培養(yǎng)基不同，甚至不同的文獻(xiàn)可能對(duì)相同的細(xì)胞培養(yǎng)基成分也是可能不同的。如我當(dāng)時(shí)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，有文獻(xiàn)就選用 neurobase 培養(yǎng)基，而我的實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕亲隹寡趸脱趸矫娴?，而這種培養(yǎng)基中含有抗氧化劑成分，此時(shí)，我就不得不選擇另外一種不含抗氧化劑的培養(yǎng)基。