用二氧化碳培養(yǎng)箱做海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)

海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)實驗
1、儀器
二氧化碳培養(yǎng)箱，解剖鏡，眼科鑷，眼科剪
2、動物
新生鼠（SD大鼠）
3、耗材
DMEM/F12培養(yǎng)基、聚賴氨酸

實驗步驟：
包被：培養(yǎng)前一天將培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶或皿用0.01%多聚賴氨酸包被過夜。第二天早上來吸除包被液在無菌超凈臺中自然晾干后放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中備用。
配制神經(jīng)元專用培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1%谷氨酰胺，2% B27，1%雙抗）
取腦：選取新生24h之內(nèi)的SD大鼠數(shù)只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,斷頭處死,無菌條件下分層剪開頭皮,顱骨,用彎鑷?yán)_腦區(qū)視野，小心取出全腦，用預(yù)冷的PBS洗數(shù)次；
分離：以腦中線為起點，小心撥開大腦顳葉皮層，暴露出新月狀海馬回，小心夾出海馬組織，置于預(yù)冷的PBS中，仔細(xì)剔除微血管，用眼科剪充分剪碎組織。
消化：加入同體積0.125%的胰蛋白酶，放入培養(yǎng)箱中消化30分鐘，期間每隔5分鐘輕搖一下。
過濾：加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打，動作務(wù)必輕柔，用200目細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液。
接種：1000rpm離心5分鐘，去除上清，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打，調(diào)整細(xì)胞濃度為100000個每毫升，接種于包被好禁止晃動。
換液：6小時后將DMEM/F12培養(yǎng)液全量換成神經(jīng)元專用培養(yǎng)液，第48小時后加入一定濃度的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞過度生長，隨后每3天半量換液。